亚洲带绦虫膜联蛋白B2基因的表达、纯化及免疫学分析
【摘要】 目的对亚洲带绦虫膜联蛋白B2(Annexins B2)进行克隆表达及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出Annexins B2基因,并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用Western blotting进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及重组质粒DNA测序均显示重组体构建成功,并得到高纯度的蛋白,且该重组蛋白可被亚洲带绦虫、猪带绦虫及牛带绦虫患者的血清识别。结论亚洲带绦虫成虫Annexins B2基因可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达。
【关键词】 亚洲带绦虫;膜联蛋白B2;基因克隆;免疫反应性
ABSTRACT: ObjectiveTo clone and express the gene named as Annexins B2 of Taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant odsBy online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the Taenia saginata asiatica full-length cDNA plasmid library, the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then transformed to BL21 with IPTG induction. Thereafter, the gene product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition, the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by Western ltsAs demonstrated by PCR, double enzyme digestion and DNA sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. The recombinant protein tested with Western blotting analysis could react with Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus infected patient lusionThe Annexins B2 of Taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.
KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; Annexins B2; gene cloning; immunoreactivity
鉴于亚洲带绦虫与猪带绦虫及牛带绦虫在起源、分类学地位存在的差异[1-2],本课题组率先构建亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库,并对该虫进行功能基因组的研究工作[3]。本文利用生物信息学工具从文库中筛选到了一个膜联蛋白B2(Annexins B2)的同源基因,构建了原核表达载体,并对其原核表达产物进行免疫学方面的初步研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1血清、载体与菌株3种人体带绦虫患者血清取自粪检阳性的带绦虫患者。原核表达质粒pET-28a(+)及大肠埃希菌BL-21/DE3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。
1.1.2主要试剂和工具酶Ex Taq酶(含dNTP),BamHⅠ,XhoⅠ,T4 DNA连接酶 (大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美国Promega公司);质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、兔抗人二抗、3,3二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1Annexins B2基因的识别及扩增将获得的亚洲带绦虫Annexins B2基因进行BLASTX分析。并根据已获得的该基因全长编码序列的开放阅读框,利用软件设计引物(引物由上海联合基因公司合成),分别带上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点进行PCR反应。
1.2.2重组原核表达质粒的构建及鉴定PCR产物和pET-28a(+)载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收、连接后转入大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞,对阳性克隆依次进行质粒的提取、双酶切和PCR鉴定,并进行重组质粒DNA测序鉴定(测序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重组蛋白的表达及纯化按照常规方法进行蛋白诱导表达,考马斯亮兰蛋白染色液染色观察蛋白表达情况。确定蛋白表达后,进行大量的诱导表达,并判断重组蛋白的可溶性,再将样品加入预先处理好的Ni-IDA 树脂亲和层析纯化柱中,最后再用PBS 24h透析以去掉过柱时留下的咪唑。
1.2.4Western blotting分析重组蛋白的免疫反应性用3种人体带绦虫患者及正常人血清与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG进行Western blotting鉴定。
2结果
2.1Annexins B2基因的识别和序列分析该基因全长922bp,编码区为224~686bp。其最大ORF为其完整编码区。
2.2原核重组质粒的鉴定将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定,产物行0.8g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500bp左右有一清晰条带,与目的基因大小基本相符。此外,重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列一致,证明重组质粒构建成功(图1)。
2.2蛋白表达及纯化结果将构建好的重组质粒转化到 BL/DE3中,超声裂解后SDS-PAGE电泳分析结果显示在大约25ku处出现高效表达条带(图2),与目的蛋白基本相符。测得纯化产物的蛋白浓度为0.526g/L。
2.3Western blotting鉴定纯化蛋白的免疫反应性
用感染亚洲带绦虫、猪带绦虫、感染牛带绦虫的患者血清以及亚洲带绦虫感染猪的血清与纯化蛋白反应的结果均显示出较清晰的条带,而阴性对照血清在相应位置未识别出该蛋白条带(图3),表明该表达产物具有良好的免疫反应性。图1重组质粒的PCR和双酶切鉴定 Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1:DNA标准(DL2000);1:PCR产物;2:pET-28a(+)质粒双酶切;3:pET-28a(+)-Annexins B2重组质粒双酶切;M2:DNA标准(DL 15000)。图2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大肠埃希菌中的表达产物及其纯化产物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product M:蛋白Marker;1:pET-28a(+)IPTG未诱导;2:pET-28a(+)IPTG诱导;3:pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未诱导;4:pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG诱导;5:pET-28a(+)-Annexins B2上清;6:pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7:pET-28a(+)-Annexins B2纯化蛋白。
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