探究人脐带间充质干细胞生物特性比较论文

引言 Introduction

间充质干细胞是一类起源于中胚层的非造血干细胞，具有多向分化的潜能，能够为细胞治疗提供理想的种子细胞，同时也能作为基因治疗的载体细胞，目前已从骨髓、胎盘、脂肪、脐血、脐带、滑膜等组织器官中分离出间充质干细胞。体外培养的间充质干细胞形态均一，平行生长或漩涡状生长，能够表达多种表面抗原，如高表达间质细胞标志(CD44、CD90、CD105)，不表达造血干细胞标志(CD34、CD45、CD14)、内皮细胞标志(CD31、CD33)及人白细胞抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)等。在特定条件下间充质干细胞可以分化为成骨细胞、神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞及肝细胞等。相比其他间充质干细胞，本实验选用的人脐带间充质干细胞具有种子细胞的很多优良特性，如增殖活性高、免疫原性低、无致瘤性等，且来源充足，无伦理问题。现阶段用于分离间充质干细胞的方法主要有以下几种：贴壁组织块法、流式细胞仪分选法、胶原酶消化法及其改进方法等。每种方法各有利弊，贴壁组织块法原代培养时间较长，液体的浮力使组织块漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量，但细胞活性保持良好。流式细胞仪分选法虽然所获得的细胞纯度较高，但实验成本较大，亦难获得足够的细胞数量。普通胶原酶消化法费用较高，虽然可在短时间内获得细胞，但常温中消化时间长可能损伤细胞，致使细胞不易贴壁，不易传代;消化时间短液体较黏稠，难以离心获得足够量细胞。胰酶冷消化法曾用于培养乳鼠心肌细胞，与温胰蛋白酶消化法比较，胰酶冷消化法所需实验条件简单，因为不需搅拌和多次酶消化、清洗的烦琐过程，胰蛋白酶用量少，节约大量的人力物力，而且冷消化相对细胞活性损伤较轻。本实验首次采取胰酶冷消化法分离脐带间充质干细胞[23]，从细胞形态、生长曲线、细胞表面标记物及诱导分化能力4个方面与传统组织块法比较，为不同需求的科研工作者获得较多的脐带间充质干细胞、更完整的细胞结构及其功能以满足实验要求并能达到更节约人力、物力提供一些资料。

1 材料和方法 Materials and methods

设计：对比观察细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年6月至2014年3月在新疆医科大学干细胞研究室完成。

材料：足月健康新生儿脐带组织取自新疆医科大学第五附属医院妇产科，产妇及家属均知情同意，采集后装于盛有无菌生理盐水的50 mL离心管中，4 h内处理。

实验方法：

脐带间充质干细胞的原代培养：胰酶冷消化法：取足月健康新生儿脐带组织，剔除组织中的血管，用PBS反复冲洗去除血迹，剪碎至大小约1 mm3，放入50 mL离心管中，加入PBS离心(1 200 r/min)5 min，洗涤3遍，之后取离心后的组织块放入培养皿中并加入稀释后的胰酶(PBS与胰酶同比例混合)10 mL，用封口膜封死培养皿边缘，放入4 ℃冰箱过夜。第2天取出培养皿中的`组织于50 mL离心管中，放入37 ℃水浴箱中15 min，之后加入L-DMEM用巴氏管充分吹打，静置1 min待组织块沉底后吸取上清液于15 mL离心管中。上述步骤重复操作2遍，尽量收集上清液，加入15 mL离心管离心(1 200 r/min)10 min，去除上清液加入含体积分数为20%胎牛血清培养液。混匀后加入培养皿中，放入37 ℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度条件下培养，每3 d换液1次。培养14 d左右，当细胞达到大部分融合时，用胰酶消化传代，并将组织转移到一个新的培养皿中，按上述方法继续培养。组织块培养法：取足月妊娠分娩胎儿脐带，用PBS洗涤数遍，去除残留血迹。把脐带剪切成4.0 cm左右的片段并剔除血管(1条脐静脉，2条脐动脉)，之后将其剪成大小约1 mm3的组织块，然后平摊置于55 mm培养皿中并加入2 mL胎牛血清加以固定。2 h后，按比例加入含有青链霉素、谷氨酰胺、维生素C及碳酸氢钠的L-DMEM培养基约8 mL，放置在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。每隔3 d半换液1次。观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80%-90%融合度时，用胰酶消化传代，并将组织转移到一个新的培养皿中，按上述方法继续培养。

脐带间充质干细胞的生物学特性：细胞形态：两种方法培养的原代细胞通过普通倒置显微镜观察其形态变化。生长曲线：取上述两组第2代脐带间充质干细胞以每孔5×103/cm2的浓度接种于24孔板中。采用胰酶消化锥虫蓝染色法，每日取4孔计数细胞，绘制细胞生长曲线，细胞达到生长抑制时停止实验。流式细胞仪检测细胞表面标记特征：胰蛋白酶消化第3代脐带间充质干细胞，1 200 r/min离心5 min，细胞重悬。调整细胞浓度为1×106 L-1，与抗CD29，CD34，CD45，CD105单克隆抗体室温反应30 min，PBS洗涤2次后，与FITC或PE标记的二抗避光作用30 min，将洗涤后的细胞重悬于PBS中，待测。诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞：取传至第3代的脐带间充质干细胞，置于诱导培养基(含2%B27、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子的DMEM/F12培养基)中培养，倒置显微镜下观察细胞的形态变化。取诱导第3天的脐带间充质干细胞，行荧光免疫化学检测，细胞爬片在室温下用40 g/L多聚甲醛固定，经PBS预清洗，血清封闭，滴加兔抗人神经巢蛋白抗体(1∶400)，置湿盒中4 ℃下过夜。加入Alexa Fluor 594标记的羊抗兔IgG抗体(1∶200)，37 ℃下孵育0.5 h。以PBS作为阴性对照。

主要观察指标：①两种方法培养的原代脐带间充质干细胞最早出现时间及培养周期。②两种方法培养的脐带间充质干细胞的形态。③两种方法培养的脐带间充质干细胞的生长曲线。④两种方法培养的脐带间充质干细胞的细胞表面标记特征。⑤两种方法培养的脐带间充质干细胞向神经干细胞多向分化的潜能。

统计学分析：用SPSS 17.0统计学软件处理，做t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1 两种方法培养的原代脐带间充质干细胞最早出现时间及培养周期

使用上述两种方法均可获得人脐带间充质干细胞，组织块法在种植后第5-7天才见到细胞从组织块爬出，最早观察细胞贴壁时间为(5.80±0.84) d，而胰酶冷消化法在消化种植后第2，3天就可见到细胞贴壁生长，最早观察细胞贴壁时间为(2.60±0.55) d，差异有显著性意义(P < 0.05)。但两种方法得到的原代细胞达到90%-95%融合的时间差异无显著性意义(P > 0.05)，组织块法为(14.4±1.67) d，胰酶冷消化法为(14.6±0.90) d。

2.2 两种方法培养的脐带间充质干细胞形态观察及生长情况

胰酶冷消化法培养两三天就可见单个贴壁细胞，呈圆形或短梭形，培养10 d左右，细胞形态逐渐伸展开来，大体呈长梭形，但少数细胞边缘不光滑，为多角形，不规则，细胞的体积较大，培养2周之后，细胞已逐渐形成漩涡状的集落，且逐渐变大，细胞增多，即可传代。传代后的细胞生长速度明显增快，数量增多，四五天即可传代1次。组织块法培养5 d左右亦可观察到个别细胞沿组织块边缘爬出，呈短梭形、纤细;随后细胞数量增多，慢慢向外扩长，形态类似成纤维细胞，并逐渐形成漩涡状的集落，培养13-16 d，可见细胞集落逐渐变大，细胞增多，即可传代。

2.3 第3代人脐带间充质干细胞的生长曲线

两组细胞的增殖曲线近似“S”型，细胞种植后第一二天处于潜伏期，从第3天起细胞开始进入对数增殖期，于第8天左右进入平台期;组织块法获得第3代细胞的增殖速率显著快于胰酶冷消化法，在进入对数生长期后的各个时间点细胞数量差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 两种方法培养的脐带间充质干细胞表面抗原检测

为了明确脐带来源贴壁生长细胞是否与骨髓间充质干细胞具有相同的抗原标志表达，取上述第3代脐带间充质干细胞样细胞经流式细胞仪检测，结果显示，上述细胞不表达CD34，CD45，而表达CD29、CD105，即表达了骨髓间充质干细胞的常见抗原标志。

2.5 两种方法培养的脐带间充质干细胞向神经干细胞多向分化的潜能

两种方法培养出来的第3代人脐带间充质干细胞加入诱导液后第2天均可看到部分细胞聚集成团漂浮于诱导液当中，呈椭圆形或圆形，随着诱导时间增长，漂浮的神经球样细胞越来越多，且越来越大，免疫荧光显示神经球样细胞表达神经干细胞特征性标志物nestin阳性。

3 讨论 Discussion

脐带是联系胎儿与胎盘的一种管状结构，在胎儿正常分娩时被当作废弃物丢弃。故利用脐带来分离扩增间充质干细胞属于变废为宝，几乎不涉及伦理道德问题，易于收集，不易污染，可以在短时间内获得足够数量的细胞;其次，脐带间充质干细胞比较原始，分化、增殖分化能力强，生物活性稳定，而骨髓间充质干细胞在骨髓内含量较少且增殖能力随着年龄的增长而显著下降，故易受到供者年龄的限制。Weiss等也通过CFU-F培养法检测显示脐带中间充质干细胞含量明显多于骨髓液。因此脐带间充质干细胞以其独特的优点，逐渐成为干细胞中最具有应用前景的种子细胞。

本实验使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞，组织块法在种植后第5-7天才见到细胞从组织块爬出，而胰酶冷消化法在消化种植后两三天就可见到细胞贴壁生长，差异有显著性意义(P < 0.05)。但两种方法得到的细胞达到90%-95%融合的时间差异无显著性意义(P > 0.05)，镜下可见细胞均为贴壁生长，呈成纤维细胞样，但胰酶冷消化法培养的少数细胞呈多角形，不规则，细胞的体积较组织块法大。组织块法获得第3代细胞的增殖速率显著快于胰酶冷消化法，在进入对数生长期后的各个时间点细胞数量差异有显著性意义(P < 0.05)，提示冷消化法对原代的脐带间充质干细胞有损害作用。两种方法获得的细胞经3代以上培养，均呈现长梭形贴壁形态，与骨髓间充质干细胞为金标准一样，具有与其相同的表面标志，如表达CD29、CD105，不表达CD34、CD45，具有间充质干细胞的特性。脐带间充质干细胞经诱导后呈现神经球样形态，漂浮于诱导液当中，表达神经干细胞特异性标志——nestin蛋白;进一步将这些细胞球分离成单细胞悬液，继续传代培养，发现单个的细胞又很快变成类似原代培养时出现的岛屿状细胞球，充分显示了神经干细胞有别于一般神经细胞的增殖特性，说明人脐带间充质干细胞在特定的培养液中具备形成神经干细胞的潜力和特性;实验中所采用的培养条件可以保证神经干细胞的生成与存活环境，有人把神经球继续诱导可以表达NSE、GFAP、NF-M、S100、Tubulin等神经元或神经胶质特异性表达标志物，为将来以诱导人脐带间充质干细胞成神经干细胞作为种子细胞进行体内移植治疗脊髓损伤提供了实验依据。

实验结果显示：胰酶冷消化法与组织块法均能培养出人脐带间充质干细胞，具有相同的表面标志及诱导成神经干细胞的能力。组织块法的优点：简单易行，无需放入4 ℃冰箱过夜，操作时间短，而且原代培养时间也与酶消化法无明显差异，细胞形态保持良好的长梭形，此法对细胞无明显损害，细胞活性较冷消化法强。缺点：液体的浮力使组织块漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量。胰酶冷消化法通过研究仅原代细胞爬出时间较组织块法早，其他无明显优势，故胰酶冷消化法虽然可以同样培养出人脐带间充质干细胞，但并没有想象中有那么多优点，相对而言操作变得烦琐且时间长，细胞形态也受到损害。故对于培养人脐带间充干细胞，组织块法要优于胰酶冷消化法。