CLA对HepG2细胞脂肪堆积的影响

【摘要】目的 研究共轭亚油酸对HepG2细胞中脂质沉积的影响。方法  以HepG2细胞为研究对象，以不同浓度CLA（10μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1）作用细胞24小时，采用油红染色、RT-PCR等方法检测肝脏脂肪沉积、ACC mRNA表达，观察CLA对肝细胞内脂质沉积的影响。结果  CLA增加HepG2细胞中脂质沉积，50μmol·L-1CLA组细胞中红染脂滴与对照组相比明显增多；CLA使HepG2细胞培养液中游离脂肪酸降低，50μmol·L-1组的培养液中游离脂肪酸与对照组相比含量降低了50%（P< 0.05）；CLA增加HepG2细胞ACC mRNA的表达，ACC mRNA表达水平随CLA浓度增加而增高。结论  CLA可增加HepG2细胞的脂肪沉积；其机制可能与CLA能够改变肝细胞中ACC的表达有关。
【关键词】共轭亚油酸 (CLA)   HepG2细胞  脂肪代谢  ACC
        共轭亚油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是由一组具有共轭不饱和双键的亚油酸的异构体构成的混合物。1987年Michael Pariza研究小组分离出CLA，能够抑制化学诱导的皮肤肿瘤形成[1]。CLA有减轻肥胖、抗肿瘤、防止动脉粥样硬化、提高机体免疫力、增加骨密度、促进生长等多种生理功能。但是一些研究发现，CLA在减少体内脂肪的同时，可能出现肝脏脂肪代谢障碍，出现肝脏脂肪沉积的现象，其确切的分子机制尚不明确[2]。本实验就是研究CLA对肝脏细胞脂肪堆积的影响。
        1  材料
        1.1 HepG2细胞  
        第四军医大学营养与食品卫生学教研室惠赠。
        1.2 主要试剂
        高糖DMEM培养基，Gibco公司；新生小牛血清，杭州四季青；胰蛋白酶，Wolsen公司，四甲基偶氮噻唑兰(MTT)，Amresco公司；油红O-0625，Sigma公司，共轭亚油酸（CLA），Sigma公司；游离脂肪酸测试盒南京建成科技有限公司；TRIZOL，Invitrogen公司；反转录试剂盒Fermentas公司葡萄糖试剂盒，上海复星公司。
        1.3 主要仪器与设备
        NU-2500E型CO2孵箱，倒置相差显微镜，YI-875SA医用超净工作台，酶联免疫检测仪，MyCycler thermal cycle，凝胶成像仪等。
        1.4 引物  
        引物由奥达公司合成，其中ACC引物为：5’-TGATGTCAATCTCCCTGCAGC-3’；5’-        TTGCCTCTTCTCTGTTTTCTCCCC-3’。
        β-ACTIN引物为：5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3;5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’。
        2  实验方法
        2.1 细胞培养
        HepG2细胞置于含10％新生小牛血清的高糖DMEM培养液中，含有100 IU/ml 青霉素，100μg/ml链霉素，37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温孵箱条件下培养，用胰蛋白酶消化液消化。
        2.2 油红O染色观察HepG2细胞脂质沉积
        将HepG2细胞接种于放有干净盖玻片的6孔板内，37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。待细胞长至80%满时，吸弃培养液，加入不同浓度CLA作用24小时后，终止培养；弃培养液，每孔加入1ml10%的甲醛溶液室温孵育5分钟。除去甲醛溶液，加入同等体积的10%甲醛室温孵育1小时，用锡纸包封好避免干燥；除去甲醛溶液，60%的异丙醇冲洗，完全干燥；加入油红O工作液放置10分钟，除去油红O立即用蒸馏水冲洗4次，晾干后在倒置显微镜下观察。
        2.3 染色法测定培养液中的游离脂肪酸
        将HepG2细胞以每孔5×104个细胞接种于24孔培养板内，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。待细胞长至80%满时，吸弃培养液，将实验组分为1%血清的DMEM培养液空白对照组（无细胞），正常细胞对照组（含1%血清的DMEM培养液）、CLA干预组(浓度为0、10、50、100μmol·L-1)，每组设3孔并列，孵箱中培养24小时后吸弃培养液，CLA干预组每孔加入1ml 100nmol·L-1的`胰岛素溶液作用1小时后，按照试剂盒说明书方法，采用比色法测定培养液中游离脂肪酸的变化，同时24孔板内细胞胰酶消化后细胞计数板计数。
        2.4 胞总RNA的提取
        用TRIZOL试剂按操作说明书提取，提取的RNA用约25μL DEPC 处理水溶解。
        2.5 RNA纯度鉴定
        取RNA5μL，稀释100倍后用紫外分光光度计测定其OD260和OD280值，并计算OD260/OD280值及RNA浓度。
        2.6 cDNA的合成
        （1）以提取的总RNA3μg为模板，cDNA合成反应体系为12μL，包括：提取的总RNA模板3μg，Primer Oligo（dT）5μL，RNase，用DEPC水补至12μL。3-5sec离心混匀，65℃加热5min后置于冰浴中。
        （2）逆转录反应 反应体系包括：5×RTbuffer 4μL；RNase Inhibitor 1μL；10mMdNTPmix 2μL；Rever Tra Ace 1μL；补水到20μL。3-5sec离心混匀，37℃孵育5min后冰浴。
        （3）加入M-MuLV反转录酶1μL，总体积为20μL。离心混匀，3-5s，42℃孵育60min。
        （4）70℃加热10min以终止反应。合成的cDNA保存于-20℃或用于扩增。
        2.7 PCR反应体系
        10×Reaction Buffer 5μL；10mM dNTPs 1μL；Primer1(P1)和 Primer2(P2) 各20pmol；cDNA 2μL；KOD-Plus 1μL； H2O 33μL，总体积为50μL。